研究揭示双功能分子协同P450酶催化系统的结构基础与过氧化物酶新功能

细胞色素P450酶是一类含血红素的单加氧酶，在药物代谢、异生物质解毒和类固醇生物合成中发挥重要作用；其具有多功能生物氧化催化、合成的应用潜力，因而备受关注。针对绝大多数天然P450单加氧酶催化功能的实现高度依赖于辅酶NAD(P)H和负责电子传递的还原伴侣蛋白的关键科学问题，中国科学院青岛生物能源与过程研究所研究员丛志奇带领的单碳酶催化课题组构建了双功能小分子（DFSM）协同P450酶催化系统，能够有效利用过氧化氢作为末端氧化剂，在解除P450酶对辅酶体系依赖的同时提高P450BM3对苯乙烯、乙苯和苯甲硫醚等非天然底物的催化活性，为基于P450酶的生物催化剂开发提供了新思路（Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 7628-7633. Very important paper, Highlighted by Chemistry Views）。

近期，单碳酶催化课题组和代谢物组学研究组研究员冯银刚团队合作，利用羟胺代替过氧化氢，制备并解析了蛋白-羟胺-双功能小分子三元复合物的高分辨率晶体结构，建立了双功能小分子协同P450活化过氧化氢的预反应态模型，为解析其分子机制提供了结构基础（图1）；进而与厦门大学教授王斌举团队合作，通过理论计算模拟，进一步阐明了双功能小分子介入活性中心氢键网络、使过氧化氢以较低能垒的异裂方式被活化，有利于反应活性物种生成，从而提高了P450酶催化活力的反应机理（ACS Catal. 2021, 11, 8774-8785）。

近年来，单碳酶催化课题组先后报道了DFSM协同P450酶催化系统高效的过加氧酶（peroxygenase）功能，如催化气态烷烃分子的选择羟化（ACS Catal. 2019, 9, 7350-7355）、木质素单体芳醚的脱甲基化（Catal. Sci. Technol. 2020, 10, 1219-1223. Inside front cover）以及苯乙烯的高度R-对映选择性环氧化（Chem. Sci. 2021, 12, 6307-6314. Back cover, highlighted in “hot off the press” in Nat. Prod. Rep. 2021, 38, 1053）。为拓展DFSM协同P450酶系统的催化多功能性，研究人员利用酶化学机制指导的蛋白质工程策略，将该系统由过加氧酶转换为过氧化物酶（peroxidase）模式，开发出DFSM协同P450酶催化系统的过氧化物酶新功能（ACS Catal. 2021, 11, 8449-8455）。

氧化物酶是一类重要的氧化还原酶，在生物催化、生物传感器和生物医学中应用广泛。在细胞色素P450酶研究中，与单加氧酶和过加氧酶催化功能相比，学界对其过氧化物酶活性的研究仍较少。研究人员基于对DFSM协同P450酶系统中三种可能催化途径的机制分析，提出了氧化还原敏感残基的竞争性氧化途径可能是阻碍该系统过氧化物酶功能的主要原因的假设，进而通过对不同种类氧化还原敏感残基进行热点筛选和迭代组合突变，开发出DFSM协同P450酶系统的过氧化物酶新功能（图2），能够高效催化愈创木酚、2,6-二甲氧基苯酚、邻苯二胺、对苯二胺的一电子氧化反应，催化性能可媲美或超过大多数天然过氧化物酶。与王斌举团队的模拟计算合作研究表明，DFSM协同P450系统中过氧化物酶活性可能来源于消除氧化还原敏感残基的竞争性氧化或蛋白质工程后底物的重定位。该研究进一步证明了DFSM协同P450酶催化系统的可塑性和在生物催化领域的应用潜力，为发展基于P450酶的生物催化剂提供了新的见解和策略。

上述研究工作得到国家自然科学基金、国家重点研发计划、青岛市创新领军人才计划、青岛能源所创新基金和山东省合成生物技术创新中心等的支持。

图1.“双功能分子-P450-羟胺”三元复合物的晶体结构

图2.DFSM促进的P450过加氧酶至过氧化物酶的功能转换